BIOKIMIA UJI PROTEIN

REAKSI UJI PROTEIN

I.                   TUJUAN PERCOBAAN

      Untuk mempelajari cara identifikasi protein dengan memanfaatkan ikatan yang khas pada protein.

II.               TINJAUAN PUSTAKA

      Protein (asal kata protos dari bahasa Yunani yang berarti "yang paling utama") adalah senyawa organik kompleks berbobot molekul tinggi yang merupakan polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptida. Asam amino adalah senyawa yang memiliki satu atau lebih gugus karboksil (-COOH) dan satu atau lebih gugus amino (-NH₂) yang salah satunya terletak pada atom karbon C α. Peptida dan protein merupakan polimer kondensasi asam amino dengan penghilangan unsur air dari gugus amino dan gugus karboksil.

      Keistimewaan dari protein adalah strukturnya yang mengandung N,disamping C,H,O (seperti karbohidrat dan lemak), S (sulfur) dan kadang-kadang P,Fe dan Cu (sebagai senyawa kompleks dengan protein). Dengan demikian maka salah satu cara terpenting yang cukup spesifik untuk menentukan jumlah protein secara kuantitatif adalah dengan penentuan kandungan N yang ada dalam bahan makanan atau bahan lain. Protein yang mengandung gugus hidroksil Phenil (- - OH) dapat bereaksi dengan larutan mercuri nitrat dan dapat menghasilkan larutan atau endapan yang berwarna merah.

      Secara kimia dapat dibedakan antara protein sederhana yang terdiri dari polipeptida dan protein kompleks yang mengandung zat-zat makanan tambahan seperti hern, karbohidrat, lipid atau asam nukleat. Untuk protein kompleks, bagian polipeptida dinamakan aproprotein dan keseluruhannya dinamakan haloprotein. Secara fungsional protein juga menunjukkan banyak perbedaan. Dalam sel mereka berfungsi sebagai enzim, bahan bangunan, pelumas dan molekul pengemban. Tapi sebenarnya protein merupakan polimer alam yang tersusun dari berbagai asam amino melalui ikatan peptide. Selain itu protein berperan penting dalam struktur dan fungsi semua sel makhluk hidup dan virus.

      Beberapa uji kualitatif dapat digunakan untuk mendeteksi adanya protein. Uji tersebut meliputi Uji Biuret, Pengendapan dengan Logam, Pengendapan dengan garam, dan Uji Koagulasi.

III.            ALAT dan BAHAN

A.    UJI BIURET

1.      Alat

a.      Tabung Reaksi

b.      Rak Tabung Reaksi

c.       Pipet Tetes

2.      Bahan

a.      Larutan NaOH 2,5 M

b.      Larutan Protein

c.       Larutan CuSO₄ 0,01 M

B.     PENGENDAPAN DENGAN LOGAM

1.      Alat

a.      Tabung Reaksi

b.      Rak Tabung Reaksi

c.       Pipet Tetes

2.      Bahan

a.      Larutan Protein

b.      Larutan HgCl₂ 0,2 M

c.       Larutan Timbal Asetat ( Pb(CH₃COO)₂)

C.    PENGENDAPAN DENGAN GARAM

1.      Alat

a.      Tabung Reaksi

b.      Rak Tabung Reaksi

c.       Pipet Tetes

d.      Spatula

2.      Bahan

a.      Larutan Protein

b.      Larutan (NH₄)₂SO₄

c.       Reagen Millon

d.      Reagen untuk uji biuret

D.    UJI KOAGULASI

1.      Alat

a.      Tabung Reaksi

b.      Rak Tabung Reaksi

c.       Pipet Tetes

d.      Spatula

2.      Bahan

a.      Larutan Asam Asetat (CH₃COOH) 1 M

b.      Reagen Millon

c.       Larutan Protein

d.      Reagen untuk uji biuret

IV.             CARA KERJA

A.    UJI BIURET

1.      2 ml putih telur dimasukkan ke dalam tabung reaksi

2.      Kemudian ditambahkan 20 tetes larutan NaOH ke dalam sampel putih telur

3.      Setelah itu ditambahkan lagi dengan 3 tetes larutan PbSO₄

4.      Catatlah perubahan yang terjadi setelah pencampuran tersebut

5.      Selanjutnya tambahkan lagi dengan 10 tetes CuSO₄

6.      Catat lagi perubahan pada campuran

B.     PENGENDAPAN DENGAN LOGAM

1.      2 ml sampel putih telur dimasukkan ke dalam tabung reaksi

2.      Kemudian ditambahkan dengan larutan HgCl₂ ke dalam sampel tersebut

3.      Catatlah apa yang terjadi setelah pencampuran

4.      2 ml sampel dimasukkan lagi  ke dalam tabung reaksi yang lain

5.      Setelah itu ditambahkan dengan 5 ml Pb (CH₃COO)₂

6.      Dan catat kembali

C.    PENGENDAPAN DENGAN GARAM

1.      5 ml sampel putih telur dimasukkan  ke dalam tabung reaksi

2.      Selanjutnya ditambahkan dengan 40 tetes (NH₄)₂SO_4, pada saat pencampuran tersebut akan timbul endapan berwarna putih/perak

3.      Siapkan 2 tabung reaksi yang bersih

4.      Endapan yang diperoleh kemudian dibagi menjadi 2 yang ukurannya masing-masing sama banyak, dimana :

a.       Tabung 1 : 5 ml Reagen Millon ditambahkan ke dalam tabung ini

b.      Tabung 2 : Pada tabung ini dilakukan uji biuret

D.    UJI KOAGULASI

1.      2 ml sampel, dimasukkan ke dalam tabung reaksi

2.      Pada sampel kemudian ditambahkan dengan CH₃COOH sebanyak 5 tets

3.      Catatlah perubahan yang terjadi

4.      Kemudian campuran tersebut dipanaskan, sampai putih telur dalam campuran itu matang

5.      Siapkan 2 tabung reaksi yang bersih

6.      Telur yang sudah masak setelah dipanaskan kemudian dibagi menjadi 2 bagian yang masing-masing ukurannya sama banyak, dimana :

a.       Tabung 1 : Reagen Millon dimasukkan ke dalamnya

b.      Tabung 2 : Lakukan Uji Biuret pada tabung ini

V.                HASIL PENGAMATAN

1.      UJI BIURET

VOL. SAMPEL PROTEIN	+ NaOH	+ PbSO4	+ PbSO4
2 ml (40 tetes)	Campuran tidak menyatu, seperti air dan minyak, warna bening kekuningan dan cairan membeku	Campuran matang berwarna bening dan setelah ditambah warna berubah menjadi kuning kecoklatan	Campuran berubah warna menjadi coklat dan campuran sudah membeku serta matang

                       

2.      PENGENDAPAN DENGAN LOGAM

VOL. SAMPEL PROTEIN	+HgCl2 (5 ml)	+(CH3COO)2 (5 ml)
2 ml (40 tetes)	Warna putih seperti telur, sudah masak tetapi belum membeku atau masih encer	-
2 ml (40 tetes)	-	Warna putih, campuran matang tetapi belum membeku atau masih encer

3.      PENGENDAPAN DENGAN GARAM

VOL. SAMPEL PROTEIN	+ (NH4)2 S04 (2 ml)	ENDAPAN + REAGEN MILLON	ENDAPAN + BIURET
5 ml (100 tetes)	Sampel tidak tercampur, massa telur lebih ringan sehingga berada diatas campuran, berwarna bening dan telur belum matang	Sampel campuran matang dan berwarna bening	Telur matang dan berwarna biru serta terdapat warna coklat dan ungu

                       

4.      UJI KOAGULASI

VOL. SAMPEL PROTEIN	+ CH3COOH	DIPANASKAN	ENDAPAN REAGEN MILLON	ENDAPAN + BIURET
2 ml (40 tetes)	Terjadi endapan telur belum belum matang dan berwarna bening	Telur matang dan berwarna putih	Warna kuning lama kelamaan berwarna coklat dan telur membeku	Warna berubah coklat dibagi atas dan warna bening dibagian dasar tabung, telur yang matang melayang diantara larutan

VI.             HASIL PERCOBAAN DAN PEMBAHASAN

      Pada berbagai uji kualitatif yang dilakukan terhadap beberapa macam protein, semuanya mengacu pada reaksi yang terjadi antara pereaksi dan komponen protein, yaitu asam amino tentunya. Beberapa asam amino mempunyai reaksi yang spesifik pada gugus R-nya, sehingga dari reaksi tersebut dapat diketahui komponen asam amino suatu protein.

      Prinsip dari uji millon adalah pembentukan garam merkuri dari tirosin yang ternitrasi. Tirosin merupakan asam amino yang mempunyai molekul fenol pada gugus R-nya, yang akan membentuk garam merkuri dengan pereaksi millon. Dari hasil percobaan, diketahui bahwa protein albumin dan kasein mengandung Tirosin sebagai salah asam amino penyusunnya, sedangkan gelatin dan pepton tidak. Fenol dalam hal ini digunakan sebagai bahan percobaan karena Tirosin memiliki molekul fenol pada gugus R-nya. Di sini, uji terhadap fenol negatif, walaupun secara teori tidak. Alasan yang mungkin untuk hal ini adalah kesalahan praktikan dalam bekerja.

      Pada uji biuret, semua protein yang diujikan memberikan hasil positif. Biuret bereaksi dengan membentuk senyawa kompleks Cu dengan gugus -CO dan -NH pada asam amino dalam protein. Fenol tidak bereaksi dengan biuret karena tidak mempunyai gugus -CO dan -NH pada molekulnya. Uji Biuret bertujuan untuk mengetahui ada tidaknya gugus amida pada filtrat yang dihasilkan, dimana dalam suasana basa Cu bereaksi dengan beberapa jenis larutan protein dan menghasilkan warna violet. Hasil pembentukan senyawa kompleks, reaksi biuret dapat terjadi pada molekul yang mengandung 2 gugus ( - C - NH -) yang terikat pada satu atom karbon atau atom nitrogen atau O terikat langsung. Senyawa yang mengandung gugus – C- NH – diganti O dengan gugus – C –NH2 O - C – NH2 atau gugus –CH2NH2 juga positif dalam uji Biuret. O Uji test ini diberikan nama berdasarkan nama senyawa biuret. NH2 – C – N – C – NH2, yang memberikan uji positif. Uji Biuret merupakan uji karakteristik dari protein.

      Protein juga mengendap bila terdapat garam-garam anorganik dengan konsentrasi yang tinggi dalam larutan protein. Berbeda dengan logam berat, garam-garam anorganik mengendapkan protein karena kemampuan ion garam terhidrasi sehingga berkompetisi dengan protein untuk mengikat air. Pada percobaan, endapan yang direaksikan dengan pereaksi millon memberikan warna merah muda, dan filtrat yang direaksikan dengan biuret berwarna biru muda. Hal ini berarti ada sebagian protein yang mengendap setelah ditambahkan garam.

      Pada uji koagulasi, endapan albumin yang terjadi setelah penambahan asam asetat, bila direaksikan dengan pereaksi millon memberikan hasil positif. Hal ini menunjukkan bahwa endapan tersebut masih bersifat sebagai protein, hanya saja telah terjadi perrubahan struktur tersier ataupun kwartener, sehingga protein tersebut mengendap. Perubahan struktur tesier albumin ini tidak dapat diubah kembali ke bentuk semula, ini bisa dilihat dari tidak larutnya endapan albumin itu dalam air. Protein yang tercampur oleh senyawa logam berat akan terdenaturasi. Hal ini terjadi pada albumin yang terkoagulasi setelah ditambahkan HgCl₂ dan Pb (CH₃COO)₂. Senyawa-senyawa logam tersebut akan memutuskan jembatan garam dan berikatan dengan protein membentuk endapan logam proteinat.

VII.          PERTANYAAN

1.      UJI BIURET

a.      Warna apa yang terjadi ?

Jawaban :   Jika sampel ditambahkan dengan NaOH  maka warna       menjadi bening kekuningan. Dan setelah ditambahkan dengan    PbSO₄ warna berubah lagi menjadi kuning kecoklatan.   Selanjutnya ditambahkan dengan CuSO₄ dan perubahan warna yang terjadi yaitu Cokelat.

b.      Mengapa harus dihindarkan penambahan CuSO₄ berlebih ?

Jawaban :    Cu merupakan logam berat. Jika penggunaannya terlalu banyak maka albumin akan terdenaturasi membentuk koagulan. Pada suasana alkalis akan terbentuk Cu(OH)2 dari reaksi : Cu2+ + 2OH- → Cu(OH)2 (ungu) Cu2+ berwarna biru intensif, jika berlebihan akan mengakibatkan warna ungu terkalahkan sehingga hasilnya negative

c.       Mengapa garam ammonium mengganggu uji biuret ?

Jawaban : Karena ion-ion dari garam ammonium lebih mudah dalam   mengikat air, sehingga menyebabkan kelarutan protein dalam     air  berkurang.

d.      Sebutkan dua macam zat lain selain protein yang memberikan uji biuret positif ?

Jawaban : Zat lain yang dapat memberikan uji biuret yaitu Peptida dan           Asam amino.

2.      PENGENDAPAN DENGAN LOGAM

a.      Amati apa yang terjadi ?

Jawaban : Pada percobaan ini proses yang terjadi yaitu saat sampel      ditambahkan HgCl₂ maka warna berubah menjadi putih        seperti telur masak, tetapi campuran reaksi tersebut belum                      membeku atau masih dalam keadaan encer. Dan saat         ditambahkan dengan Pb (CH₃COO)₂, warna pada campuran          kemudian berubah menjadi putih, campuran matang tapi                      belum membeku.

b.      Terangkan mengapa putih telur digunakan sebagai penawar pada keracunan Pb dan Hg ?

Jawaban :    Sebab protein yang terdapat dalam putih telur berfungsi sebagai biokatalis pengganti se-sel yang telah rusak akibat gas-gas kimia beracun dari Pb dan Hg selain itu putih telur juga digunakan sebagai antidotum terhadap keracunan logam berat karena putih telur mengandung albumin, sehingga apabila tubuh keracunan logam berat maka ion logam berat tersebut akan bereaksi dengan albumin membentuk koagulan sehingga logam berat tersebut tidak akan mengganggu atau merusak aktivitas enzim lain di dalam tubuh.

3.      PENGENDAPAN DENGAN GARAM

a.      Jelaskan hasil-hasil yang diperoleh !

Jawaban :   Saat ditambahkan dengan (NH₄)₂SO₄ sampel tidak                        tercampur, massa telur lebih ringan sehingga berada diatas campuran, warna campuran bening dan telur belum matang.        Endapan kemudian ditambahkan dengan Reagen Millon, hasil      yang diperoleh yaitu sampel campuran matang dan berwarna      bening. Pada endapan yang ditambah biuret, telur              matang         dan berwarna biru dan terdapat warana coklat dan ungu.

b.      Mengapa ammonium sulfat (NH₄)₂SO₄ mengendapkan protein ?

Jawaban :   Sebab amonium sulfat adalah salah satu garam yang bersifat         higroskopis yang dapat menyerap air.

4.      UJI KOAGULASI

a.      Mengapa ditambahkan asam ke dalam larutan protein ?

Jawaban :

b.      Protein apa yang menggumpal pada pendidihan ?

Jawaban :

VIII.       KESIMPULAN

      Protein dan asam amino memberikan reaksi yang bersifat khas, bukan hanya bagi gugus amino dan gugus karboksil bebas, tetapi juga bagi gugus R yang terkandung di dalamnya. Protein dapat bereaksi dengan pereaksi-pereaksi lain seperti juga asam amino yang menjadi penyusunnya. Protein dapat mengendap atau terdenaturasi oleh logam berat, garam-garam anorganik, rusaknya struktur tersier dan kwartener, serta karena berada pada titik isolistriknya.

      Berdasarkan reaksi antara protein dengan garam anorganik, dapat diambil kesimpulan bahwa dalam percobaan pengendapan oleh garam, kelarutan protein akan berkurang bila kedalam larutan protein ditambahkan garam-garam anorganik, akibatnya protein akan terpisah sebagai endapan. Hasil reaksi baik dengan pereaksi millon dan pereaksi biuret memberikan hasil yang positif yang membuktikan bahwa bila garam netral yang ditambahkan berkonsentrasi tinggi, maka protein akan mengendap.

Albumin dapat diendapkan oleh penambahan garam. Kedua endapan tidak bisa larut kembali dalam air, hanya terpecah menjadi partikel yang lebih kecil saat pengadukan dan terdispersi di semua bagian air sehingga tampak larut pada percobaan ini. Endapan yang terbentuk menunjukan hasil positif terhadap reagen milon dengan berubahnya warna endapan menjadi oranye kecoklatan, hal ini menunjukan bahwa endapan yang terbentuk benar-benar merupakan endapan protein.Protein akan terkoagulasi oleh pemanasan.